Sequence Based Typing (SBT)

Sequence Based Typing (SBT)

Sequence Based Typing (SBT)

Il sequenziamento (SBT) rappresenta il metodo più completo per la caratterizzazione dei polimorfismi della regione HLA. I kit commerciali utilizzati per SBT, si basano su due tecnologie, amplificazione tramite PCR e sequenziamento automatico diretto del DNA tramite fluorescenza.

I geni di interesse vengono amplificati in una miscela di amplificazione utilizzando AmpliTaq Gold. L'amplificato risultante, trattato con ExoSAP‐IT per rimuovere i primer non incorporati e i dNTP, verrà utilizzato come templato per il sequenziamento del DNA con BigDye Terminators. Le sequenze di DNA vengono in seguito rilevate tramite un sequenziatore automatico di DNA a fluorescenza e i dati vengono analizzati con un programma di tipizzazione degli alleli HLA.

I kit SBT sono suddivisi in 4 categorie:

  • S1: Amplificazione locus-specifica (1 amplificazione per campione)
  • S2: Amplificazione gruppo-specifica (4 amplificazioni per campione)
  • S3: Amplificazione gruppo-specifica (8 amplificazioni per campione)
  • S4: set per sequenziamento singolo allele specifico (16 amplificazioni per campione)

Aumentando il numero di amplificazioni per campione, aumenta il grado di separazione degli aplotipi, riducendo le ambiguità.

Sono disponibili sempre in SBT :

  • Prodotti Domino Stone, che consentono una amplificazione gruppo‐specifica per i campioni di cui è già nota la tipizzazione a bassa risoluzione;
  • Prodotti Domino Stone CT, che sono nuovi primers pensati per risolvere le ambiguità Cis/Trans che si ottengono dai kit di sequenziamento S4. Sono primers di sequenza liquidi validi per la classe I (A*,B*,C*) e II (DRB1* e DQB1*);
  • Prodotti Domino Stones 2.0, che permettono di sequenziare esoni addizionali al di fuori delle regioni ipervariabili (esoni 2 e 3 per la classe I e esone 2 per la classe II), rispetto ai domino originali. I Domino Stones 2.0 sono utili per risolvere P‐Groups e ambiguità Cis/Trans, per risolvere G‐Groups, per  risolvere Null Alleles e per pubblicare nuovi alleli che differiscono al di fuori delle regioni ipervariabili di classe I e II.

Per tutti i kit in SBT l’estrazione non è compresa.

 

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